Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Fundamentos y aplicaciones

Técnica de PCR

v  Desarrollada por el Dr. Kary Mullis en 1983.

v  Es un método para la amplificación exponencial selectiva de una región elegida dentro de una molécula de ADN.

v   Permite el copiado in vitro de ADN y ADNc.

Agua libre de nucleasas

v  Agua grado PCR libre de RNAsas y DNAsas.

v  Provee el medio en el cual se llevaran a cabo las reacciones necesarias para la replicación del ADN.

 Catión divalente

Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq polimerasa para que incorpore los dNTP´s.

Desoxinucleótidos

Son 4 los dNTP´s involucrados en un PCR típico; dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Provee de nucleótidos (base + azúcar + fosfato) a la reacción para la síntesis de ADN.

Se incorporan a un ADN molde de manera complementaria, para realizar una copia exacta de este.

 Sol. Amortiguadora y sales para PCR.

Amortiguador

v  Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe.

Sales

v  Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima.

v   Influye en la Tm e hibridación.

 Oligonucleótidos

v  Secuencias cortas de ADN (18-25 bases), que sirven como punto de inicio de la replicación del ADN.

v  Moléculas lineales con un grupo hidroxilo en el extremo 3´.

v   Secuencias complementarias al ADN blanco.

Taq polimerasa

v  Dirige la síntesis de ADN durante la replicación.

v   La Taq polimerasa fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus en 1976.

v   Es termoestable y actúa en la presencia de iones de magnesio.

v   La temperatura óptima de la enzima son 72ºC.

Las cadenas de ADN son separadas en dos hebras sencillas.

Los primers se unen por complementariedad a las cadenas molde, deacuerdo a su Tm.

La enzima Taq polimerasa, adiciona los nucleótidos correspondientes en las nuevas cadenas sintetizadas por complementariedad de pares de bases.v  Es el primer paso en la técnica de PCR, en la cuál las cadenas complementarias de ADN son separadas por calentamiento.

 Los puentes de hidrógeno entre las dos hebras de ADN 

v  son rotos y estas se separan.

Pasos de la Técnica de PCR

Las cadenas de ADN son separadas en dos hebras sencillas.

Los primers se unen por complementariedad a las cadenas molde, deacuerdo a su Tm.

La enzima Taq polimerasa, adiciona los nucleótidos correspondientes en las nuevas cadenas sintetizadas por complementariedad de pares de bases

Desnaturalización

v  Es el primer paso en la técnica de PCR, en la cuál las cadenas complementarias de ADN son separadas por calentamiento.

 Los puentes de hidrógeno entre las dos hebras de ADN son rotos y se separan.

Alineación

Proceso en el que dos secuencias de ADN (primers y cadena molde) forman puentes de hidrógeno. La alineación se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reacción, después del paso de desnaturalización según la Tm de los primers empleados

 Elongación del ADN

La Taq polimerasa se une al templado de ADN y comienza a adicionar los nucleótidos que son complementarios a la cadena molde. La temperatura óptima de acción de la enzima Taq polimerasa son 72ºC.

 Análisis del producto amplificado por PCR convencional 


 Después de la amplificación al obtener el ADN de interés, este puede ser colocado en un gel de agarosa para realizar el corrimiento electroforético, teñirlo y observarlo con luz ultravioleta (UV).

La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en campo eléctrico.

Los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato, por lo que migrarán hacia el polo positivo o ánodo.

Gel de agarosa

v  La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida.

v  Gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 a 45°C y funde a temperaturas entre 80 a 95°C.

v  La agarosa es un producto natural y no tóxico, por lo que puede ser manejado libremente y de forma cómoda en el trabajo.

v  La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%, dependiendo del tamaño del poro requerido para la corrida electroforética y este a su vez del tamaño del ácido nucleico a analizar.

v   la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa.

Bromuro de etidio

v  Es un colorante fluorescente que tiene la capacidad de intercalarse entre las bases nitrogenadas de ADN y ARN.

v  Debido a esta propiedad, es un agente mutagénico y debe manejarse con cuidado, usando equipo de protección y las buenas prácticas de laboratorio establecidas


v  Los efectos biológicos de esta radiación se inician por una absorción fotoquímica a nivel de moléculas de importancia biológica, las más importantes en este sentido son los ácidos nucleicos, seguidos por las proteínas.

v  Es importante tomar las medidas necesarias para no exponerse a este tipo de radiación durante la revelación de los productos amplificados en el gel de agarosa.

 PCR en tiempo real

v  En esta técnica de laboratorio, los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente en el mismo vial cerrado, sin necesidad de acciones posteriores.

v  Los termocicladores para llevarla a cabo, incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir en cualquier momento de la amplificación del material genético, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice esta.

v   Los sistemas de detección para la PCR en tiempo real pueden ser de 2 tipos: agentes intercalantes o sondas específicas marcadas con fluorocromos.

Agentes intercalantes

v  Fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice.

v   El más empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I.

v  El incremento de ADN en cada ciclo, se refleja en un aumento proporcional de fluorescencia emitida en cada vial donde se realiza la amplificación.

v  Uno de los inconvenientes de estos es su baja especificidad, que se puede mejorar con el empleo de condiciones óptimas de reacción y con una selección cuidadosa de los primers o cebadores.

v  Sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor.

v   El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas.

v  Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y las sondas FRET.

 En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporción de fluorescencia emitida.

Sondas de hidrólisis

v  Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador en el extremo 5´ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3´ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador.

v  Mientras la sonda este intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor.

v  Durante la síntesis de la nueva cadena por la Taq polimerasa, que tiene actividad 5´ exonucleasa, el extremo 5´ de la sonda es hidrolizado, produciéndose la liberación del fluorocromo donador

Una vez que el donador y aceptor están espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector


Molecular Beacon.

v  Parecidas a las sondas de hidrólisis.

v   Tienen una molécula donadora en el extremo 5´ y una molécula aceptora en el extremo 3´, además tienen una estructura secundaria en forma de asa, que se pliega y mantiene unidas ambas moléculas.

v  Al no estar hibridada con el ADN molde, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.

v  Al hibridarse con el ADN diana, la sonda se abre, alejándose donador y aceptor, pudiendo detectarse la fluorescencia emitida por el primero.

Sondas FRET

v  El sistema se compone de 2 sondas que se unen

a secuencias adyacentes del ADN diana.

v   Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo 5’. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos.

v   Al ser excitado, el donador transfiere su energía

al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia

que detecta el lector del equipo.


Equipo de Amplificación y detección de PCR en tiempo Real.
- curvas de Amplificación: 

Constan de 3 partes diferentes:

v  La fase inicial donde no se puede medir la acumulación del producto de PCR pues hay pocos cambios en la señal de fluorescencia, lo que define la línea basal.

v  La fase exponencial, donde la fluorescencia cambia a medida que se forman más productos.

v   La fase de meseta, donde no se distinguen cambios en la fluorescencia a pesar de que se siguen acumulando productos.

Comparación de PCR tiempo real y PCR convencional

                                                                                     
Tiempo Convencional                                              Tiempo Real

v  Prueba de detección de punto final.      *Tiempo Real de la cinética de la reacción.

v   Detección por empleo de geles de           *Detección simultanea                 agarosa, aparte de la reacción de                durante el proceso de                                                                           
       PCR                                                                amplificación
                                                                            

v   Poder de resolución                                  * Detección de cambios 
      limitado.                                                  mínimos en las secuencias.

v  Obtención de resultados en dos pasos        *Prueba simultanea.

 (amplificación y detección).                   (amplificación y detección)

v  Más tiempo en obtención de                        con menor tiempo de espera.

resultados.